兔肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫检测试剂盒使用说明书
使用前仔细阅读本说明书。本酶联免疫试剂盒是基于双抗体夹心技术原理，来检测兔肿瘤坏死因子α（TNF-α），只能用于研究用途，不得用于医学诊断。
用 途： 用于兔血清、血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的测定。
工作原理
本试剂盒采用的是双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）测定样品中兔肿瘤坏死因子α（TNF-α）的水平。向预先包被了兔肿瘤坏死因子α（TNF-α）单克隆抗体的酶标孔中加入肿瘤坏死因子α（TNF-α），温育；洗涤后，加入HRP标记过的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入底物A、B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中兔肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度呈正相关。
试剂盒组成
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1 |
标准品（640ng/L） |
0.5ml |
7 |
显色剂A液 |
6ml |
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2 |
标准品稀释液 |
3ml |
8 |
显色剂B液 |
6ml |
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3 |
酶标包被板 |
12孔×8条 |
9 |
终止液 |
6ml |
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4 |
酶标试剂 |
6ml |
10 |
说明书 |
1份 |
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5 |
30倍浓缩洗涤液 |
20ml |
11 |
封板膜 |
2张 |
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6 |
样品稀释液 |
6ml |
12 |
密封袋 |
1个 |
需要而未提供的试剂和器材
1． 37℃恒温箱。
2． 标准规格酶标仪。
3． 精密移液器及一次性吸头
4． 蒸馏水，
5． 一次性试管
6． 吸水纸
注意事项
1． 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2． 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
3． 建议所有标准品、样本都做双份检测。如标本中待测物质含量过高，请先用PBS稀释一定倍数（n倍）后再按说明书操作进行测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
4． 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准。
5． 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。
6． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
7． 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。
洗板方法
手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
标本要求
1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。
操作程序
1． 标准品的稀释：（本试剂盒提供原倍标准品一支，用户请按照说明自行在小试管中倍比稀释）：
320ng/L （5号标准品） 120μl的原倍标准品加入120μl的标准品稀释液
160ng/L （4号标准品） 120μl的5号标准品加入120μl的标准品稀释液
80ng/L （3号标准品） 120μl的4号标准品加入120μl的标准品稀释液
40ng/L （2号标准品） 120μl的3号标准品加入120μl的标准品稀释液
20ng/L （1号标准品） 120μl的2号标准品加入120μl的标准品稀释液
2． 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入稀释好的标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。
3． 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。
4． 每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育30分钟。
5． 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。
6． 每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。
7． 取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
8． 测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
9． 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。
操作程序总结：
准备试剂，样品和标准品
加入准备好的样品和标准品，37℃反应30分钟
洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟
洗板5次，加入显色液A、B，37℃显色10分钟
加入终止液
15分钟之内读OD值
计算
检测范围：10ng/L→400ng/L。
规格： 96T/盒
保存： 2-8℃
有效期： 6个月（2-8℃）。