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 技术文章
免疫荧光参考实验步骤
作者:江苏镇江厚普生物科技有限公司  来源:  发表时间:[2011-11-4]  点击:5022

一、细胞免疫荧光

1. 细胞爬片;

2. 冷丙酮4固定15min(或用4%多聚甲醛室温固定10~20min);

3. 空气干燥5minPBS漂洗3min3次;

4. 细胞通透:0.5% Triton X-100(溶于PBS)通透细胞,室温15~30min(丙酮固定法不用此步骤);

5. PBS漂洗2次,每次5min

6. 3% H2O2去离子水室温孵育10minPBS洗;

7. 正常山羊血清封闭,37孵育10~20min,甩掉封闭液,勿洗

8. 加适当比例的一抗工作液孵育,4过夜或37 1~2h

9.  PBS漂洗2次,每次5min

10. 加入荧光二抗工作液,3730-60min

11. PBS漂洗2次,每次5min

12. DAPI染色2~5minPBS漂洗2次,每次5min

13. 抗淬灭封片剂封片;

14. 荧光显微镜观察,拍片。

二、冰冻切片

1. 冰冻切片室温放置30分钟后,入4丙酮固定10分钟,也可根据需要选择其他方式。PBS洗,5min3次;

2. 3% H2O2去离子水37孵育10minPBS洗,5min2次;

3. 510%正常山羊血清封闭,37孵育10-20min,倾去血清,勿洗

4. 适当比例的一抗工作液孵育,4过夜或37 12h

5. 复温20minPBS3min,三次;

6. 加入荧光二抗工作液,3730-60min

7. PBS漂洗2次,每次5min

8. DAPI染色2~5minPBS漂洗2次,每次5min

9. 抗淬灭封片剂封片;

10. 荧光显微镜观察,拍片。

三、石蜡切片

1. 常规石蜡切片60烤片2小时;

2. 脱蜡。二甲苯脱蜡15min,两次;

3. 水化。依次用无水乙醇、95%90%80%70%,各一次2min,之后在蒸馏水中孵育5min

4. 1×PBSpH7.4)浸泡5min

5. 抗原修复:高压修复(EDTApH8.00.01M枸橼酸钠缓冲溶液,pH6.0高压10-15min),PBS2-3min

6. 3% H2O2去离子水37孵育10minPBS洗;

7. 正常山羊血清封闭,37孵育10-20min勿洗

8. 适当比例的一抗工作液孵育,4过夜或37 1h

9. 复温20minPBS3min,三次;

10. 加入荧光二抗工作液,3730-60min

11. PBS漂洗2次,每次5min

12. DAPI染色2~5minPBS漂洗2次,每次5min

13. 抗淬灭封片剂封片;

14. 荧光显微镜观察,拍片。

 

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