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 技术文章
TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤
作者:江苏镇江厚普生物科技有限公司  来源:  发表时间:[2011-11-4]  点击:3499

一、TUNEL细胞凋亡试剂盒内容

凋亡细胞的原位末断转移酶标记法(TUNEL法)

    细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是:细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。大量DNA片段暴露出的3’-羟基在末断转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)DNA多聚酶的作用下,与生物素或地高辛标记的核苷酸结合,最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP,使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。

    TUNEL细胞凋亡试剂盒由Roche公司提供

    试剂1 酶浓缩溶液(Enzyme Solution),10×浓缩液;

    试剂2 标记溶液(Lable Solution),1×浓缩液;

  试剂3 转化剂-PODConverter-POD),酶标记抗荧光素抗体(即用型)。

自备试剂:

PBS

双蒸水、

二甲苯、

梯度乙醇(10095908070%)、

DAB工作液(临用前配制,5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS)、

Proteinase K工作液(10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl pH 7.4-8)或细胞通透液(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate,临用前配制)、

苏木素或甲基绿、

DNase 13000 U/ml3 U/ml in 50 mM Tris-HClpH 7.510 mM MgCl21 mg/ml BSA)等。

操作流程图:制作石蜡切片脱蜡、水合细胞通透TUNEL反应液converter-POD→与底物DAB反应显色光学显微镜计数并拍照。

二、TUNEL细胞凋亡试剂盒参考操作步骤:

1. 用二甲苯浸洗2次,每次5min

2. 用梯度乙醇(10095908070%)各浸洗1次,每次3min

3. PBS漂洗2次;

4. Proteinase K工作液处理组织15-30 min 21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min

5. PBS漂洗2次;

6. 制备TUNEL反应混合液,处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液,阳性对照组先加入100μl DNase 1,反应在15~25℃×10min,后面步骤同处理组。

7. 玻片干后,加50μl TUNEL反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h

8. PBS漂洗3次;

9. 可以加1PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm,检测波长为515~565nm);

10. 玻片干后加50μl converter-POD于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min

11. PBS漂洗3次;

12. 在组织处加50~100μl DAB底物,反应15~25℃×10min

13. PBS漂洗3次;

14. 拍照后再用苏木素或甲基绿复染,几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。

15. 加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)。

三、 注意事项

1. 进行PBS 清洗时,每次清洗5 min

2.  PBS清洗后,为了各种反应的有效进行,请尽量除去PBS 溶液后再进行下一步反应。

3. 在载玻片上的样本上加上实验用反应液后,请盖上盖玻片或保鲜膜,或在湿盒中进行,这样可以使反应液均匀分布于样本整体,又可以防止反应液干燥造成实验失败。

4. TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导酶活性的失活。

5. 如果20×DAB 溶液颜色变深成为紫色,则不可使用,需重新配制。

6. 用甲基绿(Methyl Green)染液(3-5%甲基绿溶于0.1M 醋酸巴比妥 pH4.0)染色后,请用灭菌蒸馏水清洗多余的甲基绿。然后进行洗净(100%乙醇)、脱水(二甲苯)透明、封片后通过光学显微镜观察操作。如果此时使用80~90%的乙醇洗净时,甲基绿比较容易脱色,注意快速进行脱水操作。

7. 荧光素标记的dUTP液含甲次砷酸盐和二氯钴等致癌物,可通过吸入、口服等途径进入机体,注意防护。

8. 试剂保存:未打开的试剂盒贮存在-20℃-15~25℃);converter -POD液一旦解冻,以后就保存在4℃2~8℃)下,至少在6 个月内稳定,避免再次冻存;TUNEL反应液临用前配好后,放至冰上直至使用。

9. 结果分析时注意:在坏死的晚期阶段或在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量DNA片断,从而引起假阳性结果;而有些类型的凋亡性细胞死亡缺乏DNA断裂或DNA裂解不完全,以及细胞外的矩阵成分阻止TdT进入胞内反应,进而产生假阴性结果。

 

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